熒光定量PCR是分子生物學(xué)實(shí)驗手段，也是檢驗科常用的方法。它通過(guò)熒光染料或熒光標記的具有特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標記跟蹤，可以實(shí)時(shí)在線(xiàn)監控反應過(guò)程，結合相應的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測樣品模板的初始濃度，也被稱(chēng)為實(shí)時(shí)熒光定量pcr。
它是在PCR定性技術(shù)基礎上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)不僅實(shí)現了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實(shí)現多重反應、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染性、具實(shí)時(shí)性和準確性等特點(diǎn)，目前已廣泛應用于分子生物學(xué)研究和醫學(xué)研究等領(lǐng)域。在該技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念是Ct值。C代表Cycle, t代表threshold, Ct值的含義是：每個(gè)反應管內的熒光信號到達設定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線(xiàn)性關(guān)系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可做出標準曲線(xiàn)，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線(xiàn)上計算出該樣品的起始拷貝數。
熒光定量pcr常用的兩種方法分別為：熒光染料摻入法和探針?lè )?/div>
1、熒光染料摻入法
熒光染料摻入法原理是：在PCR反應體系中，加入過(guò)量熒光染料，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的染料分子不會(huì )發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。
2、探針?lè )?/div>
探針?lè )晒舛縫cr原理是：PCR擴增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個(gè)報告熒光基團和一個(gè)淬滅熒光基團。探針完整時(shí)，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成同步。
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