實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量PCR檢測技術(shù)誕生以來(lái)，越來(lái)越受到實(shí)驗室老師的青睞。 熒光定量PCR原理：熒光定量PCR早稱(chēng)TaqManPCR，后來(lái)也叫Real-TimePCR，是美國PE（PerkinElmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來(lái)實(shí)現其定量功能的。其原理：隨著(zhù)PCR反應的進(jìn)行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強度信號，這樣我們就可以通過(guò)熒光強度變化監測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線(xiàn)圖。
一般而言，熒光擴增曲線(xiàn)可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數級的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線(xiàn)性關(guān)系，根據終的PCR產(chǎn)物量也不能計算出起始DNA拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和CT值。
熒光域值（threshold）：是在熒光擴增曲線(xiàn)上人為設定的一個(gè)值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設置是PCR反應前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍，即：threshold=10XSDcycle6-15。熒光域值設定在PCR擴增的指數期。
Ct值：是指每個(gè)反應管內的熒光信號到達設定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數。
Ct值與起始模板的關(guān)系：研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線(xiàn)性關(guān)系，起始拷貝數越多，Ct值越小。PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數擴增期（對數期），此時(shí)微小誤差尚未放大，Ct值的重現性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩定的。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線(xiàn)，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值如下圖所示。
因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線(xiàn)上計算出該樣品的起始拷貝數。
其中：Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復2遍，Ct值也會(huì )存在差異。
熒光定量檢測：熒光定量檢測根據所使用的標記物不同可分為熒光探針和熒光染料。熒光探針又包括Beacon技術(shù)（分子信標技術(shù)，以美國人Tagyi為代表）、TaqMan探針（以美國ABI公司為代表）和FRET技術(shù)（以羅氏公司為代表）等；熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現在常用的SYBRGreenⅠ；飽和熒光染料有EvaGreen、LCGreen等。
SYBRGreenI是熒光定量PCR常用的DNA結合染料，與雙鏈DNA非特異性結合。在游離狀態(tài)下，SYBRGreenI發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合，其熒光增加1000倍。所以，一個(gè)反應發(fā)出的全部熒光信號與出現的雙鏈DNA量呈比列，且會(huì )隨擴增產(chǎn)物的增加而增加。
雙鏈DNA結合染料的優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗設計簡(jiǎn)單，僅需要2個(gè)引物，不需要設計探針，無(wú)需設計多個(gè)探針即可以快速檢驗多個(gè)基因，且能夠進(jìn)行熔點(diǎn)曲線(xiàn)分析，檢驗擴增反應的特異性，低的初始成本，通用性好，因此國內外在科研中使用比較普遍。
熒光探針?lè )ǎ═aqman技術(shù)）：PCR擴增時(shí)，加入一對引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一直線(xiàn)型的寡核苷酸，兩端分別標記一個(gè)熒光報告基團和一個(gè)熒光淬滅基團，探針完整時(shí)，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR儀檢測不到熒光信號；PCR擴增時(shí)（在延伸階段），Taq酶的5'－3'切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步，這也是定量的基礎所在。
熒光定量PCR的應用：
分子生物學(xué)研究:
1.核酸定量分析。對傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測,比如近期流行的甲型H1N1流感，轉基因動(dòng)植物基因拷貝數的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。
2.基因表達差異分析。比較經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等)，特定基因在不同時(shí)相的表達差異以及cDNA芯片或差顯結果的確證
3.SNP檢測。檢測單核苷酸多態(tài)性對于研究個(gè)體對不同疾病的易感性或者個(gè)體對特定藥物的不同反應有著(zhù)重要的意義，因分子信標結構的巧妙性，一旦SNP的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的SNP檢測將會(huì )變得簡(jiǎn)單而準確。
4.甲基化檢測。甲基化同人類(lèi)的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥，Laird報道了一種稱(chēng)作Methylight的技術(shù)，在擴增之前先處理DNA，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和Taqman探針來(lái)區分甲基化和非甲基化的DNA，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。
醫學(xué)研究：
1.產(chǎn)前診斷：人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無(wú)法治療，到目前為止，還只能只能通過(guò)產(chǎn)前監測，減少病嬰出生，以防止各類(lèi)遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測其Y性別決定區基因是一種無(wú)創(chuàng )傷性的方法，易為孕婦所接受。
2.病原體檢測：采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類(lèi)乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進(jìn)行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
3.藥物療效考核：對乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過(guò)程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。
4.腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發(fā)病的機理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實(shí)時(shí)熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進(jìn)行過(guò)端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達檢測。
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