引物優(yōu)化設計

　　良好的引物探針設計是數字PCR實(shí)驗獲得成功的關(guān)鍵因素之一。這正是眾多研究人員選擇LNA（鎖核酸技術(shù)）的原因——LNA修飾的引物和探針采用了成熟可靠的算法設計，獲得了科學(xué)家的信賴(lài)。

　　使用不合適的引物可能會(huì )引入引物二聚體、非特異性擴增等，進(jìn)而影響實(shí)驗結果的準確性。在此，小Q建議您在設計引物時(shí)需做以下幾個(gè)方面的檢查，需對設計好的引物進(jìn)行BLAST比對分析，以確保引物的特異性！

　　在數字PCR定量實(shí)驗中，對于基因突變檢測、基因表達差異分析和拷貝數變異鑒定等對實(shí)驗性要求較高的實(shí)驗，需要特異性更高的Assay。QIAGEN基于QIAcuity數字PCR平臺開(kāi)發(fā)并驗證了針對上述常見(jiàn)應用的700多組dPCRLNAAssay，所有Assay均經(jīng)過(guò)鎖核酸修飾來(lái)增強其對互補序列的親和力和特異性，進(jìn)而提高實(shí)驗結果的準確性。

　　鎖核酸技術(shù)優(yōu)勢

　　樣品制備

　　值得注意的是，在gDNA長(cháng)度≥20kb或進(jìn)行拷貝數變異檢測實(shí)驗時(shí)，必須對樣品進(jìn)行酶切處理，確保大片段DNA序列或串聯(lián)序列在酶切處理后，模板隨機且均勻的進(jìn)入獨立反應體系，以實(shí)現準確和精確的定量。

　　建議酶切位點(diǎn)

　　數字PCR實(shí)驗離不開(kāi)包含有Mg2+、dNTP、Buffer和DNA聚合酶等PCR反應所需要的MasterMix。隨著(zhù)實(shí)驗的不斷深入，對于實(shí)驗條件的要求也不斷提高，其中DNA聚合酶對實(shí)驗的準確性起著(zhù)至關(guān)重要的作用。由于非熱啟動(dòng)的DNA聚合酶在反應體系易使引物在室溫條件下發(fā)生非特異性擴增，直接影響實(shí)驗結果。為確保實(shí)驗順利進(jìn)行，QIAcuityEGPCRKit和ProbePCRKit均采用抗體修飾的熱啟動(dòng)DNA聚合酶，利用小分子鎖扣(Guardmolecular)將DNA聚合酶與抗體緊密結合形成雙保險，使其室溫條件下失活，只有通過(guò)95℃高溫2分鐘才能開(kāi)啟小分子鎖扣，激活DNA聚合酶活性，有效避免了非特異性擴增現象。

　　熱啟動(dòng)DNA聚合酶技術(shù)

　　樣品分區微反應單元體積大小一致且穩定是泊松分布準確計算的前提。樣本反應液在進(jìn)行液滴分散過(guò)程中由于液體表面張力、操作不當等影響，導致其部分發(fā)生融合和破裂。融合使液滴體積變大，破裂則導致有效分區數量變少更增加了交叉污染的風(fēng)險。因此，整個(gè)實(shí)驗過(guò)程需嚴格按照標準流程進(jìn)行實(shí)驗操作。相較于液滴式分區，QIAcuity數字PCR搭配的Nanoplate采用納米微孔設計，利用微流體技術(shù)將數字PCR反應體系分配到大小均一且固定微孔中，并在分區完成后自動(dòng)封閉所有微孔聯(lián)通管道，真正意義上實(shí)現獨立均一的微反應體系。

　　熱循環(huán)過(guò)程PCR擴增效率的高低直接影響終信號的判讀和實(shí)驗結果分析。在進(jìn)行熱循環(huán)實(shí)驗時(shí)，需檢查樣品的密封性以及PCR反應板是否和PCR儀熱蓋*接觸，確保PCR過(guò)程中樣品反應液沒(méi)有蒸發(fā)。QIAcuity數字PCR系統采用獨立的微反應腔室封閉方式，固態(tài)的物理分割和封閉可有效避免PCR過(guò)程中微反應體系的水分蒸發(fā)，確保微反應體系中樣本反應液濃度的恒定，更易實(shí)現準確和精確的定量。

　　數據分析原始數據中往往發(fā)現陽(yáng)性信號與陰性背景之間存在許多弱陽(yáng)性信號。因此需要對引物探針進(jìn)行重新設計和優(yōu)化（詳見(jiàn)引物探針優(yōu)化設計）或提升退火溫度（探針通常比引物高5~10℃），以消除疑似熒光信號的“雨區“現象；此外，陽(yáng)性信號和陰性背景間隙過(guò)小，導致終結果無(wú)法準確判讀。因此需要調整引物探針濃度（建議總反應體系引物濃度為600~800nM；探針濃度為200-400nM）或5'端前三個(gè)堿基如有G出現，則將其互補序列設計為實(shí)驗所用探針，以提高陰陽(yáng)性信號間隙，便于分析結果的準確判讀。