數字PCR實(shí)操結果及體會(huì )的特異性！ 導讀：多年來(lái)，研究人員一直缺乏工具，來(lái)高效拷問(wèn)這些差異，不過(guò)今非昔比。有了新一代DNA測序儀和質(zhì)譜儀，研究人員能夠以更高的分辨率、深度和通量來(lái)探索各個(gè)細胞之間的差異，特別是在單細胞轉錄組水平。
將細胞培養板上的細胞放在顯微鏡下觀(guān)察。表面上，它們都一樣。實(shí)際上，它們一點(diǎn)都不相同。無(wú)論是DNA或RNA的水平，還是蛋白質(zhì)或代謝物的水平，這些細胞相差甚遠，而這些差異可能對細胞行為產(chǎn)生深遠的影響。
多年來(lái)，研究人員一直缺乏工具，來(lái)高效拷問(wèn)這些差異，不過(guò)今非昔比。有了新一代DNA測序儀和質(zhì)譜儀，研究人員能夠以更高的分辨率、深度和通量來(lái)探索各個(gè)細胞之間的差異，特別是在單細胞轉錄組水平。
單細胞捕獲
目前，人們通常采用三種方法來(lái)分離單細胞。一種是熒光激活細胞分選（FACS），其中帶有特定熒光標記的細胞才會(huì )激活熒光檢測器。這些細胞隨后進(jìn)入收集板中，每個(gè)細胞占一個(gè)孔，而其余的細胞被丟棄。
據BDBiosciences的生物科學(xué)副總裁RobertBalderas介紹，FACS在單細胞分離上實(shí)現了其他方法的控制水平，這要歸功于不同顏色帶來(lái)的高分辨率。“這是一種二元的方法。如果有兩種顏色和兩種抗體，那么有四種可能性；如果是20種顏色，那么有220萬(wàn)個(gè)組合，”他說(shuō)。
近，Broad研究院的LeviGarraway及其同事就采用了一種簡(jiǎn)單的方案，利用CD45的表達和細胞活力來(lái)分析人黑色素瘤中4645個(gè)腫瘤、免疫和基質(zhì)細胞的轉錄組3。
BDBiosciences的款儀器，FACSymphonyA5細胞分析儀，提供了50個(gè)通道的分辨率（48種顏色再加正向和側向散射），理論上有1.1萬(wàn)億個(gè)組合。據Balderas介紹，目前研究人員已利用這個(gè)平臺來(lái)區分30個(gè)通道，而40色的panel應該很快面世。
單細胞分離的另一種方法是顯微操作，它利用玻璃微針，每次捕獲一個(gè)細胞，并轉移到目的容器中。這個(gè)過(guò)程可手動(dòng)開(kāi)展，或通過(guò)自動(dòng)化系統開(kāi)展，適合低復雜度的樣品，但略顯沉悶。
一個(gè)選擇是微流體，比如Fluidigm的C1單細胞制備系統。與的Single-CellmRNASeqHT芯片相結合，C1可平行捕獲800個(gè)細胞，并開(kāi)展RNA分離和cDNA合成。這家公司的Polaris™系統也具有捕獲、培養、刺激和制備樣品的能力，可平行處理48個(gè)細胞，從而使研究人員能夠探索單個(gè)細胞的功能。
文獻中也經(jīng)常報道新的微流體設計。今年1月，麻省理工學(xué)院的ScottManalis及其同事介紹了一種微流體“流體力學(xué)捕獲芯片”，能夠捕獲和培養細胞；之后隨著(zhù)免疫細胞的生長(cháng)和分裂，比較各代之間的轉錄變化1。
在分離出單個(gè)細胞后，研究人員可采用多種工具來(lái)定量基因表達水平。就目前而言，的也許是單細胞RNA-Seq，或者它的衍生形式–單核RNA-Seq，其中單個(gè)細胞核被分離出來(lái)并測序2。
下一步分析
10XGenomics公司近在BioRxiv預印本網(wǎng)站上介紹了一種特別高通量的RNA-Seq方法。它基于GemCode技術(shù)，可以對每個(gè)樣品中數萬(wàn)個(gè)單細胞的3’mRNA進(jìn)行計數。這家公司用它來(lái)分析68000個(gè)外周血單核細胞，并根據其轉錄特征來(lái)分級，檢測到所有預期的細胞種類(lèi)（如T細胞、B細胞和自然殺傷細胞等）。
另一種流行的方法是單細胞qPCR。當然，研究人員也經(jīng)常用RNA原位雜交及相關(guān)方法。AdvancedCellDiagnostics的醫療官RobMonroe認為，在驗證RNA-Seq和PCR表達分析時(shí)，RNAISH特別有用，因為它在細節上的優(yōu)勢彌補了通量上的不足。
RNAISH“沒(méi)有新一代測序的通量或多重分析能力”，Monroe說(shuō)。“不過(guò)你獲得的東西也同樣重要：它們能夠看到RNA在組織背景、細胞的形態(tài)學(xué)背景以及周?chē)M織中的表達。”
AdvancedCellDiagnostics的RNAscope是一種新型的RNAISH技術(shù)。兩條相鄰的“Z探針”在特定轉錄本上雜交，為高度分支的檢測探針樹(shù)的組裝提供了支架，這實(shí)現了信號放大。Monroe表示，單次結合可作為400個(gè)探針?lè )肿拥闹Ъ?，從而使信號放?00倍。利用顯色試劑可拷問(wèn)兩個(gè)不同的RNA目標，而利用熒光試劑可拷問(wèn)三個(gè)。
的華裔學(xué)者、哈佛大學(xué)的莊小威教授將RNAISH延伸到每個(gè)細胞中的1000個(gè)轉錄本。她的團隊開(kāi)發(fā)出一種名為MERFISH（多重容錯熒光原位雜交）的方法，為每個(gè)轉錄本分配一個(gè)*的16位條形碼，然后通過(guò)一系列雜交、成像和淬滅的步驟來(lái)讀取4。
在一篇發(fā)表于《NatureMethods》的評論文章中，賓夕法尼亞大學(xué)的JimEberwine及其同事寫(xiě)道，“盡管單細胞測序讓人們無(wú)比興奮，但它仍不是一種常規的實(shí)驗操作?；炯夹g(shù)以及數據分析和解釋的改進(jìn)對精確測定很重要，同時(shí)需要大樣本量來(lái)了解單個(gè)細胞的作用”5。
其他的單細胞方法也是如此。隨著(zhù)文獻中出現越來(lái)越多的改進(jìn)，相信更多的研究人員會(huì )踏上單細胞分析之路。隨之而來(lái)的，將是更多隱藏在大規模培養物背后的生物學(xué)秘密被揭開(kāi)。
地址：北京市通州區經(jīng)濟開(kāi)發(fā)區南區漷興三街1號
郵箱：biolink2018@163.com