數字PCR技術(shù)的原理
數字PCR（DigitalPCR-dPCR）技術(shù)是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統定量PCR（qPCR）技術(shù)不同，數字PCR采用定量的方式，不依賴(lài)于標準曲線(xiàn)和參照樣本，直接檢測目標序列的拷貝數。由于這種檢測方式具有比傳統qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到廣泛的應用，這項技術(shù)在極微量核酸樣本檢測、復雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面變現出的優(yōu)勢已被普遍認可，而其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結果驗證等諸多方面具有的廣闊應用前景已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注。
數字PCR采用的策略概括起來(lái)非常簡(jiǎn)單，就是“分而治之”（divideandconquer），這種做法非常類(lèi)似于計算機科學(xué)中的“分治算法”，將一個(gè)標準PCR反應分配到大量微小的反應器中，在每個(gè)反應器中包含或不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標分子(DNA模板)，實(shí)現“單分子模板PCR擴增”，擴增結束后，通過(guò)陽(yáng)性反應器的數目“數出”目標序列的拷貝數。在實(shí)際的數字PCR實(shí)驗中，事實(shí)上是通過(guò)呈現兩種信號類(lèi)型的反應器比例和數目進(jìn)行統計學(xué)分析，計算出原始樣本中的模板拷貝數。
數字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數，因此無(wú)需依賴(lài)于對照樣品和標準曲線(xiàn)就可以進(jìn)行精確的定量檢測；此外，由于數字PCR在進(jìn)行結果判讀時(shí)僅判斷有/無(wú)兩種擴增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設定閾值線(xiàn)的交點(diǎn)，*不依賴(lài)于Ct值的鑒定，因此數字PCR的反應受擴增效率的影響大大降低，對PCR反應抑制物的耐受能力大大提高；數字PCR實(shí)驗中標準反應體系分配的過(guò)程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數字PCR技術(shù)也特別適合在復雜背景中檢測稀有突變。
數字PCR技術(shù)的發(fā)展歷史
從以上介紹我們可以看到，事實(shí)上數字PCR與傳統的定量PCR兩者皆定位于同樣的平臺基礎——聚合酶鏈式反應和雙鏈DNA標記技術(shù)，但兩者采用的是*不同的定量策略和思想方法，dPCR和qPCR并沒(méi)有實(shí)驗方法和思路上的承繼關(guān)系，從這個(gè)角度來(lái)說(shuō)，目前很多人把數字PCR稱(chēng)為第三代PCR技術(shù)并不準確。
在實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)成熟和發(fā)展之前，早在1992年，南澳洲弗林德斯醫學(xué)中心的科學(xué)家使用有限稀釋、PCR和泊松分布數據校正模型的方法（limitingdilution,PCRandPoissonstatistics），檢測了復雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因，進(jìn)行了極其精細的定量研究，雖然當時(shí)這種方法并沒(méi)有被冠以“數字PCR”之名，但已經(jīng)建立了數字PCR基本的實(shí)驗流程，更重要的是了數字PCR檢測中一個(gè)極其重要的原則——以“終點(diǎn)信號的有或無(wú)”（all-or-noneendpoint）作為判斷標志，這也是之后1999年BertVogelstein和KenKinzler將之命名為“數字PCR”(digitalPCR)的主要原因。
數字PCR技術(shù)的原理非常簡(jiǎn)單，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節上卻遇到了無(wú)法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應的載體，或者采用類(lèi)似流式技術(shù)的磁珠乳液擴增方法(BEAMing-Beads,Emulsion,Amplification,Magnetics)，2006年Fluidigm公司推出了臺商品化的基于芯片的商品化數字PCR系統。2008年德國Inostics推出基于磁珠法乳濁液擴增和流式檢測方式的BEAMingdPCR檢測服務(wù)，但這些方法無(wú)論在分散程度和數據群體的體量上都無(wú)法達到更加精細的要求，時(shí)間和耗材成本嚴重限制了dPCR技術(shù)的發(fā)展。
近幾年來(lái)，隨著(zhù)納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)（nanofabricationandmicrofluidics）的發(fā)展，數字PCR技術(shù)遇到了突破技術(shù)瓶頸的佳契機。1997年Kalinina,、BrownJ,和SilverJ使用納升級芯片進(jìn)行單克隆模板PCR擴增，獲得了美國，更重要的是這種采用“電浸潤法”進(jìn)行納升級芯片制造技術(shù)顯露雛形。伴隨二代測序技術(shù)發(fā)展起來(lái)的“油包水PCR”技術(shù)，可以一次生成數萬(wàn)乃至數百萬(wàn)個(gè)納升甚至皮升級別的單個(gè)油包水微滴，可以作為dPCR的樣品分散載體。
QuantaLife利用油包水微滴生成技術(shù)開(kāi)發(fā)了微滴式數字PCR技術(shù)，這也是早出現的相對成熟的數字PCR平臺，在運行成本和實(shí)驗結果穩定性方面都基本達到了商品化的標準。2011年，QuantaLife公司被Bio-Rad公司收購，其微滴式數字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號儀繼續在市場(chǎng)上銷(xiāo)售，這個(gè)早期型號為dPCR概念的普及和應用領(lǐng)域的拓展發(fā)揮了重要作用。2013年該公司又推出了升級型號QX200。
2012年，RainDance公司推出Raindrop型號數字PCR設備，這個(gè)設備將其原有的二代測序文庫制備平臺技術(shù)平移到數字PCR技術(shù)平臺，在高壓氣體驅動(dòng)下，將每個(gè)標準反應體系分割成包含100萬(wàn)至1000萬(wàn)個(gè)皮升級別微滴的反應乳液，該公司的創(chuàng )始人之一DarrenLink表示這種超高的微滴數目可以為用戶(hù)“提供更高的檢測動(dòng)態(tài)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品”。
2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio3D數字PCR系統，這也是目前數字PCR市場(chǎng)上型號的產(chǎn)品。采用高密度的納升流控芯片技術(shù)，樣本均勻分配至20,000個(gè)單獨的反應孔中。在整個(gè)工作流程中，樣本之間保持*隔離，可以有效地防止樣品交叉污染，減少移液過(guò)程，簡(jiǎn)化操作步驟。同時(shí)芯片式設計避免了微滴式系統可能面臨的管路堵塞問(wèn)題。
作為L(cháng)ife-technologies在OpenArray芯片平臺之外推出的全新的芯片式數字PCR系統，值得一提的是，這個(gè)全新的系統在設計理念上綜合考慮了系統穩定性與運行成本因素，直接反映了該系統“適合所有分子生物學(xué)實(shí)驗室使用的數字PCR系統”的市場(chǎng)定位。
數字PCR技術(shù)的應用領(lǐng)域
從上世紀90年代以來(lái)qPCR技術(shù)的爆發(fā)式發(fā)展使得現代核酸檢測技術(shù)具有全新的面貌，而進(jìn)入二十一世紀之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA測序技術(shù)正在迅速發(fā)展，也是目前競爭為激烈的研究領(lǐng)域之一，即使在這種情況下，dPCR技術(shù)仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學(xué)領(lǐng)域爭取到屬于自己的一席之地。即使在一些傳統的qPCR應用領(lǐng)域，也有一些實(shí)驗室同時(shí)選擇dPCR平臺進(jìn)行平行實(shí)驗以保證實(shí)驗結果的準確和可重復性。
在基因組變異研究領(lǐng)域，群體基因組水平上的SNP（SingleNucleotidePolymorphism，單核苷酸多態(tài)性）檢測面臨的問(wèn)題主要是突變序列往往與大量正常序列同時(shí)存在，競爭性反應嚴重影響突變序列的檢測精度，數字PCR技術(shù)帶來(lái)的*的擴增特異性在稀有突變檢測方面具有天然的優(yōu)勢，在癌癥標志物檢測、無(wú)創(chuàng )產(chǎn)前檢查、線(xiàn)粒體突變檢測等研究方向上，我們已經(jīng)看到dPCR的許多精彩表現。
CNV（CopyNumberVariations，拷貝數變異）研究需要*的定量精度以區別不同拷貝數之間的微小差異，測序方法適用于高于30%的變異率檢測，而qPCR的分辨在1.5倍左右，數字PCR通過(guò)直接計數目標基因與參照基因(拷貝數為1的基因，例如RNaseP)的數目，計算比值，直接得到目標基因的拷貝數可以達到*的拷貝數分辨精度。
除此之外，dPCR在病原微生物檢測、microRNA研究、基因表達研究、NGS測序文庫的定量、表觀(guān)遺傳學(xué)直接相關(guān)的DNA甲基化定量檢測、ChIP定量鑒定等領(lǐng)域的應用都令人極為期待，而在轉基因成分鑒定、分子標準品精確定量、環(huán)境樣本檢測等具體的應用方向上，已經(jīng)有大量實(shí)驗數據和結果證明了dPCR技術(shù)的優(yōu)良性能。
與傳統qPCR技術(shù)相比，數字PCR技術(shù)具有*的靈敏度、特異性和精確性，但截止目前而言，數字PCR對廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測方法，我們在看待數字PCR的應用前景時(shí)，更應該保持一種開(kāi)放的心態(tài)，與其說(shuō)數字PCR技術(shù)是一個(gè)新的檢測平臺，不如把它視為一種全新的技術(shù)思路和手段，在這個(gè)平臺上必將有更多的應用幫助我們深入到分子生物學(xué)研究的更高層次。
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